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影響ELISA中非特異性顯色的原因很多,如試劑盒特異性、檢驗標本中含酶標記物的干擾物,操作過程中的問題.本文就這一原因作一簡要分析,以便可以通過以上措施把非特異顯色降至zui低限度,從而提高檢測的特異性,并得到更準確、可靠的實驗結果.

1、試劑盒特異性因素 
  1.1 固相載體的選擇.ELISA中常用的固相載體有微量滴定板、小珠和小試管三種,以微量滴定板zui為常見[1].它具有良好的吸附性能,孔底透明度高,空白值低,各板之間、同一板各孔之間性能相近.聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別,各產品的質量差異很大.因此,在選擇試劑盒同時要對其使用的微孔板型號進行認證,評估.
  1.2包被物的純度.在酶聯(lián)免疫測定尤其是間接ELISA中,試劑的特異性取決于使用抗原的純度.目前由于技術條件的限制,包被用抗原或抗體的純度不可能達到100%,所以有些非特異性顯色不可避免,只能盡可能提高純度,提高特異性.目前使用的包被抗原一般為合成多肽抗原.
  1.3包被抗體的效價.具有高親和力和高特異性的包被抗體,是決定試劑特異性的重要方面.
  1.4 封閉.是ELISA中重要的一步,目的是封閉固相載體表面尚未被所占據(jù)的空隙[2],減少后續(xù)步驟中非特異性蛋白的干擾.

2、檢驗標本中含有酶標記物的干擾物
  2.1內源性干擾物:類風濕因子（RF）、黃疸等,類風濕因子是可作用于多種動物以及人IgGFc段的自身抗體,多數(shù)為IgM類,能充當抗原成分與固相及酶標抗體反應,從而呈現(xiàn)非特異性顯色.
    黃疸血標本中常含有內源性過氧化物酶,如用辣根過氧化物酶為標記物,就有可能產生非特異性顯色.
  2.2 外源性干擾物,常常因樣品采集、貯存、處理不當造成如樣品溶血,被細菌污染,標本凝集不全等.溶血標本,紅細胞溶解破裂,釋放出血紅素形成,而血紅素中的鐵卟啉是過氧化物酶的類似物,以HRP為標記的ELISA測定中,溶血標本可能會增加非特異性顯色.如有細菌污染,菌體中可能含有內源性HRP（辣根過氧化酶）[2],有國內報道酶免HBsAg試劑檢測溶血標本時可造成假陽性[3].如在冰箱中保存過久,其中的IgG可發(fā)生聚合,在間接法ELISA中可使本底加深[2].因此,血標本在采集處理時應小心,在冰箱中保存不易過久.
    標本凝集不全時,血清中會殘留部分纖維蛋白原,也易造成假陽性.

3、操作過程中的問題造成假陽性
  3.1加樣
    對于間接ELISA標本一般都要進行稀釋,如果加樣不準就會造成誤差,尤其當稀釋倍數(shù)大時,很小的誤差,會導致較大的相對誤差,使陰性（或弱陽性）標本呈陽性（或陰性）.加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出,不可產生氣泡.目前,大部分血站都已使用全自動酶免加樣系統(tǒng)處理標本,可較好地避免以上誤差.
  3.2洗滌
    在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復結果的關健一步,應引起操作者重視.無論是手工操作還是機器操作,得出不正確的結果常與不正確的洗滌有關,ELISA就是靠洗滌來達到分離游離和結合的酶標記物的目的.通過洗滌以消除殘留在板孔中沒能與固體抗原或抗體結合的物質,以及在反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質.
  3.3 溫育
    每種試劑都有其*反應模式,其中溫度和溫育時間控制是重要因素.因孵育溫度高,反應時間長,會造成整板本底高,陽性率高.溫育一般用濕盒或水浴,反應板不宜疊放,以保證各板溫度都能迅速平衡,為避免蒸發(fā),板上應加蓋.
  3.4酶標儀判讀
    作為記錄測定結果的儀器,酶標儀的性能穩(wěn)定與否,決定結果的可靠度.首先酶標儀應定期進行保養(yǎng),對濾光片要定期校正;其次酶標儀波長設置要正確,使用雙波長,一個檢測波長,一個參比波長,以消除微孔板底部劃痕、不平、指印或液面高度差異造成的光干擾.此外,在用酶標儀讀數(shù)時先擦試微孔板底部并壓平板條.由于各種酶標儀性能有所不同,使用中應詳細閱讀說明書
    綜上所述,由于酶聯(lián)免疫吸附技術目前在技術上缺乏標準化,盡管目前上以及我國有了部分標準血清或參比血清（血清盤）.但由于受方法學及技術條件的限制,在酶聯(lián)吸附測定中有時不可避免的會出現(xiàn)一定的非特異性,但我們可以通過以上措施把非特異性顯色降至zui低限底,從而提高檢測的特異性,并得到更準確、可靠的實驗結果.

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